您当前的位置:杀菌剂网综合信息 → 文章内容

抗菌纤维素纤维对金黄色葡萄球菌的抗菌过程

作者:表面接枝;抗菌纤维;季铵盐;金黄色葡萄球菌  来源:抗菌纤维素纤维对金黄色葡萄球菌的抗菌过程  发布时间:2010/1/14 9:12:46
摘 要:通过表面接枝的方法,在纤维素纤维表面引入具有抗菌功能的季铵盐聚合物,考察了抗菌纤维对金黄色葡萄球菌的抗菌过程特性。接枝抗菌材料可在短时间内迅速降低溶液中细菌的活菌量。采用TTC 活性和菌体耗氧测定法与扫描电镜观察法研究了抗菌过程。结果表明,其抗菌过程由吸附、抑制活性和破裂杀灭3 个步骤构成,被抗菌纤维吸附的金黄色葡萄球菌不具有繁殖能力。
关键词:表面接枝;抗菌纤维;季铵盐;金黄色葡萄球菌
近年来出现的高分子抗菌材料又称表面接触抗菌材料,是将抗菌基团结合在不溶性高分子载体上,不仅可以有效避免小分子抗菌剂使用时对环境的二次污染问题,而且固体表面形成高浓度消毒剂区,可加速灭菌速度。此外,固定化消毒剂有利于材料的回收和再利用。
目前共价型高分子抗菌剂的研究主要集中在季铵盐、季鏻盐及吡啶盐等。Kanazawa 对吡啶盐类抗菌剂的研究结果表明,此类抗菌剂对菌体具有强烈的吸附作用,但被吸附的菌体依然保持活性,因此吡啶盐类抗菌剂可作为微生物载体。Kanazawa 等针对季鏻盐类高分子抗菌剂,考察了鏻盐的种类、鏻盐基团在主链或者侧链的位置,鏻盐单体的侧链烷基种类等因素对其抗菌能力的影响,将此类材料的抗菌能力归于表面活性剂形成胶团从而干扰细菌细胞膜组成。但目前对于高分子抗菌剂的抗菌机理尚没有明确的定论或直接的证据。
纤维素纤维是自然界中产量巨大的天然高分子材料,具有大比表面积和生物可降解的优点。在早先的研究工作中,已经制备了一种纤维素纤维接枝季铵盐型抗菌单体甲基丙烯酰氧乙基-苄基-二甲基氯化铵(methacryloxylethyl benzyl dimethylammonium chloride)的表面接触抗菌材料,并以革兰氏阴性菌——大肠杆菌为例研究了抗菌材料对细菌的抗菌过程和杀灭作用机理。
本文以革兰氏阳性菌——金黄色葡萄球菌为例,测定金黄色葡萄球菌在该抗菌材料表面的吸附特性以及吸附后固相接触抗菌的过程和特性,并观察被吸附细菌再培养后的菌体形貌。
1 实验部分
1.1 仪器及试剂
S. aureus 菌体由清华大学化工系生化所提供,LB 培养基培养18 h。液体LB 培养基含有酪氨酸(Oxoid,UK)、酵母浸膏(Oxoid,UK)和NaCl(北京精细化工厂)。固体培养基在上述成分基础上加入2%的琼脂(WAKO)。纤维素纤维(cellulosefiber),宝洁公司。硝酸铈铵[ammonium cerium (Ⅳ)nitrate,(NH4)2Ce(NO3)6],中国医药(集团)上海试剂公司,分析纯。氯化苄(benzyl chloride,C6H5CH2Cl),上海试剂三厂,分析纯。甲基丙烯酸二甲氨基乙酯[methylacrylic acid 2-(N,Ndimethylamino)ethyl ester,C8H15NO2],东京化成工业株式会社,分析纯。
主要仪器包括:核磁共振仪,Varin,UNITY-200;FTIR 红外光谱仪,Nicolet MAGNA-IR 560;扫描电子显微镜,HITACHI SEM450。
1.2 实验方法
1.2.1 抗菌纤维制备
(1)抗菌单体制备甲基丙烯酰氧乙基-苄基-二甲基氯化铵制备过程如下:以二氯甲烷为溶剂,在单口瓶中加入甲基丙烯酸2-(N,N-二甲基胺基)乙酯(DMAE)和氯化苄,摩尔比为1∶1。加入少量对苯二酚为阻聚剂。加热回流反应6 h,冷却有大量白色晶体析出,抽滤,二氯甲烷重结晶两次,在真空烘箱中常温干燥。1H NMR(200 MHz,CDCl3):δ =7.73(d,2H),δ =7.49(t,3H),δ =5.67~6.16(m,2H),δ =5.23(s,2H),δ =4.74(t,2H),δ = 4.24(t,2H),δ = 3.40(s,6H),δ = 1.96(s,3H)。
(2)纤维素纤维接枝在 25 mL 的锥形瓶中加入1 g 纤维素纤维、硝酸铈铵、抗菌单体和10 mL
去离子水,氮气鼓泡10 min,密封,恒温水浴中反应一段时间。接枝后的纤维素用丙酮和去离子水洗涤,然后丙酮抽提12 h,干燥,称重,计算接枝率。在本文中接枝率(percentage of grafting,简称Pg)定义为接枝聚合物与原始纤维的质量比。
1.2.2 抗菌纤维吸附/抗菌动力学
取 0.2 g、0.5 g 和0.8 g 接枝抗菌材料加入到100mL、109CFU/ mL 的S. aureus 菌液中,混合菌液在37 ℃、170 r/min 条件下培养,分别培养不同时间,取100 μL 菌液,逐级稀释涂布在固体LB 培养基上,培养24 h 后测定菌落数。
1.2.3 抗菌纤维的TTC 活性测定
TTC 活性检测采用朱南文介绍的方法。2 mL的0.1 mol/L 葡萄糖溶液、2 mL 的1g/L 的TTC 溶液2 mL 和2 mL 的0.05 mol/L 的Tris-HCl 缓冲液(pH 值 8.5)直接混合,然后加入1 mL 的菌液。
混合溶液在37 ℃下静止一定时间后,加入2 滴浓H2SO4 终止反应。加入5 mL 甲苯将反应产物TF 从水相中萃取出来,取有机相4000 r/min 离心5 min,以甲苯为参比,490 nm 处测定TF 含量。
1.2.4 抗菌纤维表面的直接观察
抗菌纤维和处理过的菌体采用戊二醛固定,临界点干燥和镀金之后,利用扫描电镜观察菌体和纤维形态变化。
2 结果与讨论
2.1 抗菌纤维的表征
不同接枝率的接枝纤维素与未接枝的纤维素的FT-IR 谱图对比。在1740 cm-1 附近出现了很强的羰基吸收峰,并随接枝率的增大,吸收峰的面积增大。这说明在纤维素的表面已经成功地接枝了季铵盐聚合物。
2.2 抗菌纤维的吸附
在 100 mL 菌液中分别加入0.10 g、0.15 g、0.17g、0.30 g 接枝率为54.5%的抗菌纤维,在水平摇床中以160 r/min 转速混合,采用平板计数法测量菌液中的活菌浓度,c 表示活菌浓度,单位CFU/mL。
在相同的接触时间下,随着抗菌纤维质量的增加,菌液中的活菌浓度降低速度明显提高,最终菌液浓度显著降低。这是因为接枝纤维表面固定的季铵盐具有N+官能团带有正电荷,当与表面带有负电荷的金黄色葡萄球菌接触时,两者之间的静电作用使得菌体迅速被吸附在纤维的表面上。抗菌纤维质量的增加提高了季铵盐抗菌基团的浓度和单位容积内的电荷密度,由此导致表观吸附速度提高,吸附量增大。实验表明抗菌纤维对金黄色葡萄球菌的吸附作用力很强,并且吸附速度很快,0.30 g 接枝率为54.5%的抗菌纤维能够在5 min 内使100 mL 菌液中的活菌浓度下降8 个数量级。
2.3 抗菌纤维抑菌与灭菌作用
2.3.1 TTC 活性实验
TTC 是菌体内的一种小分子物质,可以通过细胞壁和细胞膜被活菌摄取,在脱氢酶作用下转化为红色的TF,因此测定TTC 的摄取量即可作为衡量菌体细胞活性的一个重要指标。
金黄色葡萄球菌的悬浮液整体明显呈红色。而加入抗菌纤维后,随着接触时间的不同,悬浮液中及纤维表面呈现出不同的状态。一方面,悬浮液的红色随着接触时间的增长而逐渐消失,这说明随着接触时间的增长,悬浮液中的菌体更多的被纤维吸附,活菌量明显减少,即菌体更多的富集在纤维表面。另一方面,底部抗菌纤维表面的红色随着时间的增长也逐渐消失,这说明随着接触时间的增长,菌体在纤维表面的活性逐渐降低,即纤维几十分钟内可以迅速抑制菌的活性。
2.3.2 溶氧测定实验
金黄色葡萄球菌是好氧菌,它的正常生长将消耗水中的氧,在没有底物限制的情况下,金黄色葡萄球菌的耗氧速度表明了菌整体的呼吸活性的变化。实验中混合67 mL 菌龄为18 h 的金黄色葡萄球菌菌液和0.1 g 接枝率为54.5%的抗菌纤维,接触一段时间后,检测混合液的耗氧速度。由此得到加入抗菌纤维后溶液中菌的耗氧速度的变化曲线。
由于抗菌纤维在短时间内就可以吸附99.99%以上的金黄色葡萄球菌,所以混合液溶氧变化反映了被吸附在纤维表面的金黄色葡萄球菌呼吸活性变化。在加入纤维后的10 min 内,呼吸活性快速降低;20 min 以后,菌体的呼吸活性下降趋于缓和;40 min 后,菌体的呼吸活性下降到了检测限以下,因此耗氧速度走平并接近于0。进一步证实了抗菌纤维可以迅速抑制菌的活性。
2.3.3 抗菌过程的电镜观察
通过扫描电镜可以观察到被吸附在纤维上菌体的具体形态,直观地体现抗菌纤维与金黄色葡萄球菌的相互作用。
未接枝纤维的情况,其表面光滑具有清晰的纹路,观察不到明显的菌斑,只能偶尔观察到单个菌体的存在。验证了空白纤维对金黄色葡萄球菌的吸附能力很差。抗菌纤维和金黄色葡萄球菌菌液瞬时接触,立即取出制样观察的图象。整个视野内的纤维表面都有明显的菌斑,菌体形态正常,菌体和纤维表面界线十分明显。这说明抗菌纤维对金黄色葡萄球菌的吸附速度很快,并且在抗菌的初期,对金黄色葡萄球菌无明显破坏作用。虽然大量的菌体形状比较完整,但在纤维侧面,可以观察到菌体与纤维表面的界线模糊,好像陷入了一层黏性物质中,这有可能是细胞在菌体表面已经开始被溶解。说明与纤维接触1 h 后,菌体的形态有可能已被抗菌纤维破坏。抗菌纤维同菌液接触36 h 后,纤维表面的正常形态菌体稀少,存在大量的大小不规则的颗粒物质,这应是菌体在纤维表面破裂死亡后留下的碎片。这表明抗菌纤维确实有裂菌作用,结果证实抗菌纤维对菌体杀灭相对速度较慢。
将 0.3 g 抗菌纤维与100 mL 菌龄为18 h 的金黄色葡萄球菌菌液在37 ℃、160 r/min 转速的水平摇床中混合40 min 后,取抗菌纤维贴在固体培养基上,置于37 ℃的培养箱中进行再培养。
与金黄色葡萄球菌菌液接触40 min 后进行再培养的抗菌纤维表面没有菌体生长,中纤维表面被菌体覆盖的现象形成了鲜明的对比。这说明与抗菌纤维直接接触的金黄色葡萄球菌不具有繁殖能力。
3 结论
通过实验考察了季铵盐接枝抗菌材料的灭菌过程,证实了对金黄色葡萄球菌有杀灭作用。吸附实验结果表明,未接枝的空白纤维素纤维吸附金黄色葡萄球菌量很小,而接枝后的抗菌材料对金黄色葡萄球菌具有很强的吸附能力。TTC 脱氢酶活性测定法和呼吸活性测定法证实了接枝纤维对金黄色葡萄球菌的抑制活性作用。结合扫描电镜观察结果,表明抗菌材料的杀菌过程由吸附、抑制活性和破裂杀菌构成,其中,吸附过程和抑制活性过程速度快,而破裂杀菌过程速度较慢。与抗菌纤维直接接触的金黄色葡萄球菌不具有繁殖能力。

济南多吉利工贸有限公司
百宜系列杀菌剂、防腐剂、防霉剂、消毒剂、抗菌剂
联系人:宋先生 电话13305313047
文章评论 (评论内容只代表网友观点,与本站立场无关!)

用户名: 查看更多评论

分 值:100分 85分 70分 55分 40分 25分 10分 0分

内 容:

         (注“”为必填内容。)