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壳聚糖复合生物防腐剂的抑菌效果研究

作者:壳聚糖复合生物防腐剂的抑菌效果研究  来源:壳聚糖复合生物防腐剂的抑菌效果研究  发布时间:2011-4-21 8:17:39

壳聚糖复合生物防腐剂的抑菌效果研究

摘要:本实验研究了以壳聚糖及其金属锌螯合物为主复配的五个生物防腐剂配方以及配方中的主要组分在不同pH条件下的抑菌效果。研究选定的五种指示菌是大肠杆菌(Escherichia coli)8099、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC6538、枯草杆菌黑色变种(Bacillus 曲 )ATCC9372、白色念珠菌(Candida)ATCC10231和黑曲霉(Aspergillus niger ATCC16404),采用平板培养计数法检测了从加入不同种类的菌悬液至含抑菌剂和培养基的试管中培养0、4、24、48、72和96h的活菌残留数,以活菌残留数的对数值随时问变化的趋势表示抑菌效果。结果表明:配方A、B、D、E在pH6.0以下可以抑制五种指示菌。配方A~E和单组份壳聚糖金属锌螯合物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽胞杆菌的抑制效果好,而对羟基苯甲酸乙酯主要对枯草芽胞杆菌和黑曲霉的抑制较好,对其余三种菌的抑制效果较差,所有配方对白色念珠菌的抑菌效果较其它四种指示菌的抑制效果差,这是由于实验的起始菌悬液浓度较高造成的,同一配方在起始菌悬液浓度和作用pH值均低的情况下抑菌效果好。

关键词:壳聚糖;壳聚糖锌衍生物;生物防腐剂配方;抑菌效果评价

食品在保藏过程中,极易受到微生物污染而导致腐败变质,采用防腐剂抑制微生物,延缓腐败是当今食品保鲜的重要技术之一。生物防腐剂具有高效、无毒、适用性广和性能稳定等优点,逐渐成为食品加工研究及应用的热点, 然而相对现今大量使用的化学型防腐剂,生物防腐剂在实际中未能大规模应用, 其主要原因是生物防腐剂的性价比较差, 抑菌谱不广, 如何克服这些不利因素, 是当前天然防腐剂研究必须解决的问题。

壳聚糖是一类很有潜力的天然防腐剂,它的无毒、生物可降解性及良好的生物相容性等特点使它与其它防腐剂相比具有更多优势。壳聚糖不仅对革兰氏阳性菌有很好的抗菌作用,而且对革兰氏阴性菌以及真菌的抗菌效果也非常好。除了它独特的防腐作用外,还具有很多其它生物活性,如壳聚糖进入人体的肠道后可以有效地减少人体对脂类物质的吸收, 因此摄入壳聚糖后能降低血液中的血脂含量,可起到一定的减肥作用, 同时壳聚糖还具有降低血压、增强人体抵抗力、抗病毒、抗癌等作用;另一方面壳聚糖可通过与金属盐类化合物螯合后增加抑菌效果。本实验参考消毒技术规范,通过培养平板计数法评价以壳聚糖及壳聚糖锌螯合物为主复配的生物防腐剂配方的抑菌谱和抑菌时效,并初步获得性价比合理、广谱安全、高效抑菌在实际中可应用的配方。

1 材料与方法

1.1 材料

大分子量壳聚糖(分子量为100kD,简称CS)浙江金象公司;对羟基尼金乙酯(简称NJ)、冰乙酸广东环凯微生物科技有限公司;纳他霉素(简称NT)浙江银象公司;双乙酸钠(简称SD) 无锡阳山生化有限责任公司(食品级); 壳聚糖锌螯合物(简称CS-Zn(3)) 浙江金象公司产100kD分子量壳聚糖与锌盐螯合而成的壳聚糖衍生物, 制备方法参考文献;营养琼脂或营养肉汤(用于细菌培养)、沙氏琼脂或沙氏肉汤(用于真菌培养)广东环凯微生物科技有限公司。

1.2 标准指示菌

大肠杆菌(Escherichia coli)8099、金黄色葡萄球菌 ATCC6538、枯草杆菌黑色变种(Bacillus subtilis)ATCC9372、白色念珠菌ATCC10231和黑曲霉(Aspergillus niger)ATCC16404 广东省微生物研究所检测新技术研究组。

1.-3 抑菌效果检测方法

本实验选择平板培养计数法来评估抑菌剂的抑菌效果和时效。其方法如下。

1.3.1 抑菌剂配制

称取配方A~E的抑菌剂适量,用0.5% 乙酸约250ml加热溶解,调整pH至5.0和6.0,体积误差不大于1%,具体配方及原始浓度为:

A:2.5g/L CS—Zn(3)+300mg/L NJ+100mg/L SD;B:2.5glL CS—Zn(3)+50mg/L NT+100mg/L SD;C:1.25g/LCS—Zn(3)150mg/L NJ+100mg/L SD;D:2.5g/L CS—Zn(3)+600mg/L NJ+100mg/L SD: E: 2.5g/L CS+50mg/LNT+300mg/L NJ+100mg/L SD。

按1:1比例加入双料试管中,系统中使用的浓度是原始浓度的一半。

1.3.2 双料液体培养基配制

通过pH计调整pH至5.0或6.0,121℃ ,15min(营养肉汤)或115℃,20min(沙氏肉汤)灭菌处理。

1.3.3 无菌平板配制

细菌培养用无菌营养琼脂,真菌培养用无菌沙氏琼脂。

1.3.4 菌悬液制备

用营养琼脂或沙氏琼脂进行培养后, 刮取适量菌苔至无菌生理盐水中, 制成含菌量为5×107~5×108CFu/ml的悬液, 用于评估抑菌剂的抑菌效果。

1.3.5 测试方法

2.5ml双料液体培养基+2.5ml两倍目标浓度抑菌剂,加0.1ml菌液,细菌平板于37℃培养,真菌平板于30℃培养,加菌后在培养0、3、24、48、72和96h 后取0.2ml原液涂平板,或做适当稀释后再取0.2ml涂平板,细菌平板于37℃培养培养18~24h, 真菌平板于29~30℃ 培养1~2d,计数平板上菌落数。

1.4 抑菌效果表示方法

以平板培养计数得出的菌落数的对数值对时间的曲线来表示。

2 结果与分析

2.1 抑制枯草芽胞黑色变种9372芽孢的效果

A~E五个配方和1.25g/L CS-Zn(3)、600mg/L NJ(均以系统中的使用浓度计)在pH5.0和pH6.0条件下对枯草芽胞杆菌ATCC9372的芽孢的抑制效果。

结果分析:在pH5.0时A~E五个配方、1.25g/L CS.Zn(3)和600mg/L NJ对ATCC9372芽孢的抑制均比较好,但配方A相对较差;pH6.0时A~E对ATCC9372芽孢的抑制均比较好,而600mg/L NJ和0.5% 乙酸CK较差。

2.2 抑制大肠杆菌8099的效果

A~E五个配方和1.25g/LCS.Zn(3)、600mg/LNJ在pH5.0和pH6.0条件下对大肠杆菌8099的抑制效果。

结果分析:pH5.0时A~E和1.25g/L CS.Zn(3)和0.5% 乙酸CK对大肠杆菌8099的抑制效果均较好,而600mg/L NJ对大肠杆菌8099的抑制效果较差;pH6.0时A~E和1.25g/L CS.Zn(3)对大肠杆菌8099的抑制效果均较好,其中配方B效果最好,而600mg/L NJ和0.5% 乙酸CK对大肠杆菌8099的抑制效果较差。

2.3 抑制金黄色葡萄球菌ATCC6538的效果

A~E五个配方和1.25g/L CS.Zn(3)、600mg/L NJ在pH5.0和pH6.0条件下对金黄色葡萄球菌ATCC6538的抑制效果。

结果分析:pH5.0和pH6.0条件下,A~E和1.25g/LCS-Zn(3)对金葡菌ATCC6538的抑制效果均可以,只有600mg/L NJ和CK在上述两个pH条件下对金黄色葡萄球菌的抑制效果均不好。

2.4 抑制白色念珠菌ATCC10231的效果

A~E五个配方和1.25g/L CS.Zn(3)、600mg/L NJ在pH5.0和pH6.0条件下对白色念珠菌ATCC10231的抑制效果。

结果分析:pH5.0和pH6.0条件下,配方A、B、D、E对白色念珠菌ATCC10231的抑制作用较好,其中最好的为配方E,配方B次之,而NJ、CK和配方C效果较差。

2.5 抑制黑曲霉ATCC16404的效果

A~E五个配方和1.25g/L CS.Zn(3)、600mg/L NJ在pH5.0和pH6.0条件下对黑曲霉ATCC16404的抑制效果。

结果分析:pH5.0时CK和配方D后期抑菌效果不好,其余均可以,从试管培养8d以后的情况来看,亦是配方A、C、E和NJ在两种pH条件下均可有效抑制ATCC16404的孢子萌发,抑制黑曲霉的效果较好。

2.6 单一配方抑菌谱和抑菌时效检测与分析

配方A、B、C、D、E和CS Zn、NJ在PH5.0时对5种菌的抑菌谱和抑菌时效表明:配方A、B、c、D、E和1.25g/LCS—Zn(3)对大肠杆菌8099和金黄色葡萄球菌ATCC6538的抑制效果最好,配方C对金黄色葡萄球菌ATCC6538的抑菌效果比对大肠杆菌8099好,配方A、B、C、D、E和1.25g/L CS—Zn(3)对ATCC9373芽孢的抑制效果排第3,对黑曲霉ATCC16404孢子的抑制效果排第4,在96h内除配方D外,均可抑制黑曲霉孢子的萌发,这5个配方对白色念珠菌的抑制效果最差。配方A、B、D、E对白色念珠菌的抑制效果随时间的延长,抑菌效果增加,平板上菌数减少,而配方c和0.125%CS—Zn(3)后期对白色念珠菌的抑制比前期差。而600mg/L NJ只对枯草杆菌黑色变种芽孢和黑曲孢子有较好的抑制效果, 对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的抑制效果均不理想。

2.7 不同起始菌悬液浓度的影响

控制不同起始菌悬液浓度对配方抑菌效果的影响,选定配方A,检验其对ATCC10231的抑制效果。

结果分析:同一配方在不同起始菌悬液浓度和不同PH条件下,抑菌效果不同,起始菌悬液浓度低的情况下抑菌效果好, 同时PH越低,抑菌效果越好。

3 结 论

通过配方A~E、CS—Zn(3)和NJ对五种指示菌的抑菌谱和抑菌时效测试,得出配方A、B、D、E在PH6.0和上述浓度下(相当于系统cS—Zn或CS浓度为1.25g/L)可以抑制五种指示菌, 相对来说配方E最好,考虑成本来说,配方A最经济。上述浓度下A~E和CS—Zn(3)对大肠杆菌8099和金黄色葡萄球菌ATCC6538的抑制效果较好, 对枯草芽胞杆菌的芽孢的抑制作用亦较好,而NJ(600mg/L)主要对枯草芽胞杆菌和黑曲霉较有效果,其余三种菌的抑制效果较差,所有7个配方显示的抑菌谱主要是对ATCC1023 1较有耐性, 实验证明抑菌效果与控制系统的起始菌量有关。同一配方在不同菌量和不同pH条件下抑菌效果不同,起始菌量和系统中pH值均低的情况抑菌效果好。系统中起始菌量超过1.0× 106cFU/ml时, 防腐剂的抑菌效果较差。

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