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季铵化聚乙烯亚胺的抗菌性能研究

作者:高分子抗菌剂,聚乙烯亚胺,季铵盐,抗菌性能,抗菌机理  来源:季铵化聚乙烯亚胺的抗菌性能研究  发布时间:2010/1/15 16:26:06
摘要:采用叔胺化反应与季铵化反应两步高分子反应过程,制备了季铵化的聚乙烯亚胺(QPEI);以大肠杆菌(E.coli)为致病菌体,重点研究了高分子季铵盐QPEI的抗菌活性;采用平板活菌记数法考察了季铵化度及pH值等因素对其抗菌性能的影响规律;并采用β-半乳糖苷酶活性测定法,研究了QPEI的抗菌机理.研究结果表明,QPEI具有很强的抗菌能力,对浓度为109 CFU/mL的菌悬液,在药剂量为15 mg/L、接触时间为4 min的条件下,杀菌率可达100% ;QPEI的季铵化度对其抗菌性能影响很大,季铵化度越高,抗菌性能越好;在一定的pH值范围内,pH值越高,抗菌性能越好β-半乳糖苷酶活性测定结果表明,QPEI的抗菌机理是基于杀菌过程,而不只是抑菌作用.
关键词:高分子抗菌剂,聚乙烯亚胺,季铵盐,抗菌性能,抗菌机理
高分子抗菌剂是在大分子链上键合有抗菌基团(或键合有可水解产生抗菌剂的基团)的聚合物,全球范围内对传染疾病的密切关注极大地促进了高分子抗菌剂的研究与发展.目前用于水体或医用消毒的杀菌剂大多为小分子物质,小分子杀菌剂不但会残留余毒,造成对环境的危害,而且消毒时效短 .与小分子杀菌剂相比,高分子抗菌剂具有抗挥发与抗分解稳定性、消毒时效长及残留余毒小等优点 ,更重要的是由于抗菌基团浓集在大分子链上,高分子抗菌剂具有很强的抗菌能力,尤其是聚阳离子抗菌剂(聚季铵盐或聚季磷盐),大分子链上高度的正电荷密度与良好的可接近性(亲水性),使其具有优良的抗菌活性,可用于各种消毒处理过程.目前研究者们正在研究制备具有各种结构的高分子抗菌剂,以满足社会的需求.
聚乙烯亚胺(PEI)是一种水溶性聚胺,其分子链中拥有大量的胺基N原子,商品化的PEI往往是带有支链的大分子,分子链上的伯、仲、叔胺基的比例一般为1:2:1.聚乙烯亚胺作为一种水溶性功能大分子,其特性引起了国内外学者的广泛关注,已将其应用于多个研究领域,尤其在生物医学领域,如生物大分子的分离纯化、酶的固定化、生物传感器的构建、药物释放等多个方面都有重要的应用.对于用PEI来制备高分子抗菌剂的可能性,本文进行了探索研究.通过叔胺化与季铵化两种高分子反应步骤实施了聚乙烯亚胺的季铵化,制备了季铵化的聚乙烯亚胺(QPEI),重点研究了QPEI的抗菌活性.研究发现,作为一种聚季铵盐,QPEI具有十分优良的抗菌性能,浓度仅为15 mg/L时,短时间内与浓度为10CFU/mL的大肠杆菌菌悬液接触,抗菌率便可达到100%.本文还探索研究了大分子QPEI的抗菌机理,研究结果表明,由于QPEI大分子链上密集的季铵盐基团,在静电相互作用下,QPEI大分子与菌体之间会产生强烈的吸附作用,进而穿透菌体细胞壁,与细胞膜结合并破坏细胞膜,使细胞内物质泄露,致使细菌死亡,因此,季铵盐型大分子QPEI的抗菌机理与小分子季铵盐是相同的,是基于杀菌过程,所不同的是由于季铵基团浓集的高分子效应,使QPEI与菌体之间的吸附作用力比小分子季铵盐更强,因而杀菌效能更高.本研究将功能大分子聚乙烯亚胺进行化学改性,制备出具有强抗菌活性的高分子抗菌剂,较深入地研究了高分子抗菌剂的抗菌机理,对于促进功能大分子在微生物科学与防疫消毒领域的应用具有一定的理论参考价值.
1 实验部分
1.1 原料与仪器
聚乙烯亚胺(武汉强龙化学工业有限公司.M =2 x 104, 含量为25%的水溶液),化学纯,在使用前采用紫外分光光度法准确测定其浓度;环氧丙烷(北京化学试剂公司),分析纯;氯化苄(北京化学试剂公司),分析纯;菌体:大肠杆菌(E.Coli),由山西省微生物研究所提供,牛肉膏蛋白胨培养基培养16 h;牛肉膏蛋白胨培养基含有牛肉膏、蛋白胨、琼脂及NaCl,均为市售试剂;邻硝基苯酚β一D一半乳糖苷(ONPG,Aldrich产品);磷酸盐缓冲液(PBS),自行配制.
UV2602型紫外分光光度计(美国UNIC公司);PHS一2酸度计(上海第二分析仪器厂);250B生化培养箱;不锈钢高压灭菌锅;THZ一82型水浴恒温振荡器(金坛市富华仪器有限公司).
1.2 季铵化聚乙烯亚胺的制备与表征
按文献制备季铵化的聚乙烯亚胺,典型的制备过程为(1)叔胺化反应,往聚乙烯亚胺溶液中滴加环氧丙烷(叔胺化试剂),于搅拌下维持低温反应,反应结束后,将产物混合液升温至35℃ ,蒸出未反应的环氧丙烷,即得叔胺化产物溶液;(2)在叔胺化产物溶液中加入过量的氯化苄,恒温搅拌反应一定时间,结束反应,用乙醚萃取出未反应的氯化苄,即得季铵化的产物溶液,将产物溶液在真空烘箱中蒸发干燥,即得QPEI,通过控制反应时间制得不同季铵化度的QPEI.用红外光谱与紫外光谱表征产物的化学结构(谱图从略),并使用硝酸银沉淀滴定法测定产物的季铵化度(PEI大分子链中N原子发生季铵化的摩尔百分数即为季铵化度,mol%).
1.3 QPEI对大肠杆菌抗菌能力的测定
1.3.1 测定原菌液的菌浓 取活化后的大肠杆菌,接种于液体营养培养基,37℃摇床培养16 h.备若干支洁净试管,内加灭菌蒸馏水9 mL.取1 mL大肠杆菌浓度约为lO9 CFU/mL的菌悬液(将此菌悬液浓度梯度记为lOo),采用逐级稀释法制成不同梯度菌液,取10-7,10-8,10-9梯度菌液各0.1 mL分别铺平板,于37℃下在固体营养培养基上培养24 h,对菌落数在10~100左右的平板做活菌记数,得原菌悬液的活菌浓度(即菌落形成数,CFU/mL,与原菌数成正比).
1.3.2 测定不同剂量下QPEI的抗菌能力 在若干支洁净试管中分别加入1 mL菌龄为16 h、浓度约为10 CFU/mL的大肠杆菌菌悬液,再分别加人不同体积的水,并加人浓度为0.5 mg/mL的不同体积的QPEI溶液,使最终的试液体积为10mL。得QPEI浓度不同的试液.振荡各试液,使接触时间均为4 min,然后分别逐级稀释,对QPEI浓度不同的试液,在不同梯度进行平板活菌记数,得各试液的活菌浓度(即菌落形成数,与活菌数成正比).
1.3.3 测定不同接触时间下QPEI的抗菌能力取1 mL菌龄为16 h、浓度约为10 CFU/mL的大肠杆菌菌悬液,分别加人到若干支含8.7 mL水的洁净试管中,再分别加人0.3 mL浓度为0.5 mg/mL的QPEI溶液,振荡各混合液,接触不同时间后分别逐级稀释,针对不同接触时间的试液,在不同梯度进行平板活菌记数,得各试液的活菌浓度.
1.4 季铵化度不同的QPEI的抗菌性能的测定
将5种季铵化度不同的QPEI均配成浓度为0.5 mg/mL的水溶液,再按1.3.2步骤测定5种不同季铵化度的QPEI在分别加入不同剂量时的抗菌能力.使各试液接触时间均为4 min,然后分别逐级稀释,对5种不同季铵化度的QPEI的试液,在不同梯度进行平板活菌记数,得各试液的活菌浓度.
1.5 不同pH条件下QPEI抗菌性能的测定
在若干个洁净经灭菌后的小锥形瓶中先分别加人44 mL水,再分别加人5 mL菌龄为16 h、浓度约为10 CFU/mL的大肠杆菌菌悬液(同时平行测定此原菌悬液的菌浓),最后加入1 mL浓度为0.5 mg/mL的QPEI溶液,通过加入稀盐酸与氢氧化钠溶液,分别调节各试液的pH值,使它们处于不同的数值,振荡各混合液并使接触时间均为l0min,然后分别逐级稀释,对不同pH值的试液,在不同梯度进行平板活菌记数,得各试液的活菌浓度.
1.6β-半乳糖苷酶活性测定
以ONPG为底物,测定β-半乳糖苷酶催化ONPG水解成产物邻硝基苯酚(ONP)的反应情况,以判断大肠杆菌内膜是否遭到破坏.在3份5.5mL PBS缓冲溶液中(pH为7.4),同时加入0.75mL浓度为109CFU/mL菌液和0.75 mL浓度为25mmol/L的底物ONPG,振荡15 min后分别在两只试管中加人不同体积的浓度为0.5 mg/mL的QPEI溶液,并用缓冲液将3只试管的总体积调成10mL,用分光光度计检测各试液在420 nm处吸光度值随时间的变化.
2 结果与讨论
2.1 季铵化聚乙烯亚胺的制备过程
以环氧丙烷为叔胺化试剂,使PEI大分子链上的伯胺与仲胺基团发生烷基化反应,同时环氧丙烷发生开环加成反应,生成叔胺化的聚乙烯亚胺,然后以氯化苄为季铵化试剂,使PEI大分子链上的叔胺基团发生季铵化反应,生成季铵化的聚乙烯亚胺.
2.2 PEI季铵盐对大肠杆菌的抗菌能力
使QPEI在不同剂量及不同接触时间条件下与大肠杆菌菌悬液作用.可以看出,QPEI溶液在小剂量下(约5
mg/L)、短时间内(约2 min)即可使活菌数迅速下降,对于季铵化度为54.9% 的QPEI样品,浓度为15 mg/L、接触时间为4 min的条件下,抗菌率可达100% .实验结果表明,PEI季铵盐与小分子季铵盐相比,具有很强的抗菌能力.QPEI大分子链上季铵盐抗菌基团很集中,抗菌基团的这种“浓集效应”导致了QPEI具有快的抗菌速度与高的抗菌活性.而且与其它类型的高分子抗菌剂相比,QPEI也具有更强的抗菌活性,比如Zhang等制备的高分子胍盐,其最小抑菌浓度为20 mg/L ;Jones等制备的聚乙烯吡咯烷酮一碘络合物,其最小抑菌浓度为0.0156 g/g .
2.3 季铵化度对QPEI抗菌性能的影响
考察了具有不同季铵化度的QPEI的抗菌性能.可以看到,季铵化度对QPEI的抗菌性能影响很大;季铵化度最大的QPEI溶液,在小剂量下即可达到很高的抗菌率;随着季铵化度的逐渐减小,曲线逐渐变得平缓,并且在较大药剂量时抗菌率才可达到100% .从图中取10 mg/L的剂量,作抗菌率与季铵化度的关系曲线,图中能更清楚地显示季铵化度对QPEI的抗菌性能影响.QPEI凭借季铵离子的正电荷与带负电荷的菌体之间会产生强的静电相互作用,因而大分子QPEI对菌体会产生强烈的吸附作用,其分子链上的季铵化度越高,正电荷密度越大,对菌体的吸附能力就越强,抗菌能力就越强.
2.4 pH值对QPEI抗菌性能的影响
在不同的pH条件下试验了QPEI的抗菌性能.曲线具有最低点,对应的pH值为4.5.本研究认为该最低点可能对应着大肠杆菌菌体蛋白质的等电点,即在pH= 4.5时,菌体表面不带电荷,此时QPEI与菌体之间失去了吸附推动力,故抗菌率低.等电点以右,随着pH的增大,细菌蛋白质的主要成分氨基酸中的羧基中和度逐渐增大,细菌表面的负电性变强,QPEI对菌体的吸附力增强,故抗菌率随pH值增大而提高;而当pH值增至6后,抗菌率几乎不再升高,这可能是当pH>6以后,氨基酸中的羧基全部被中和,细菌表面的负电性不再变化,QPEI对菌体的吸附力维持不变,故抗菌率不再提高.等电点以左,菌体表面带正电荷,同性电荷相斥,不利于QPEI对菌体的吸附,故QPEI的抗菌率应当很低,但(表观)抗菌率却随pH值减小而提高.对于这种现象,本文认为在pH<4.5的酸性溶液中,存在有两种抗菌作用,其一为QPEI的作用,其二为H 离子对微生物的作用,且后者随pH的减小而增强,此两种抗菌作用的协同,导致等电点以左(表观)抗菌率随pH值减小而提高.在不同pH值范围内,QPEI对大肠杆菌抗菌性能的变化规律将有待于进一步研究.
2.5 PEI季铵盐的抗菌机理
β-半乳糖苷酶对糖脂、乳糖等中的β一D一半乳糖苷键有特异的水解作用,尤其是大肠杆菌细胞内所含的β-半乳糖苷酶,对ONPG的水解反应具有底物特异性 .若大肠杆菌细胞发生破裂,则β-半乳糖苷酶会泄露到溶液中,催化溶液中的ONPG发生水解反应,产生ONP,而ONP在420 nm处有特征吸收,因此可通过分光光度法检测出大肠杆菌细胞是否破裂 .本实验在含有ONPG的菌液中分别加入两种体积量的QPEI溶液,测定了试液吸光度随时间的变化,同时也测定了空白体系(不加QPEI溶液的菌液)的吸光度,测定结果如图所示.从图中曲线看出未加QPEI溶液的菌液吸光度几乎为零,表明活细菌细胞内膜完好,无.β- 半乳糖苷酶释放;而加入QPEI溶液的菌液其吸光度值随时间推移而大幅度增大,且QPEI溶液加入量大的试液,吸光度值上升幅度更大.这表明QPEI溶液的加入,破坏了细菌细胞内膜,释放出了β-半乳糖苷酶,且QPEI溶液加入量越多,对菌体细胞内膜的破坏作用越大,释放出的酶量越多,故对ONPG的水解作用越强.细胞内膜的破坏意味着细菌的死亡,由此可以判断,QPEI的抗菌作用其实质在于杀菌,而不只是抑菌.
结合β-半乳糖苷酶活性测定结果,QPEI的抗菌机理可分析如下,带正电的QPEI首先被吸附到菌体表面,穿透细胞壁,与细胞膜的类脂层和蛋白质层结合,阻碍细菌对外界的正常离子交换和物质交换,并破坏控制细胞渗透作用的原生质膜,使细胞内物质外渗,致使细菌死亡.
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