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表面接枝季铵盐型高分子材料抗菌过程的特性研究

作者:表面接触消毒剂;季铵盐;大肠杆菌;耗氧速度  来源:表面接枝季铵盐型高分子材料抗菌过程的特性研究  发布时间:2010/1/13 9:24:51
摘要:考察了一种表面接枝季铵盐型高分子材料对水溶液中大肠杆菌的抗菌过程特性.发现此材料可以在短时间内迅速降低溶液中的大肠杆菌的活菌量.用菌体耗氧测定法与扫描电镜观察法研究了其抗菌过程.结果表明.其抗菌过程由吸附和杀灭两个步骤构成.其中吸附过程由纤维与大肠杆菌表而静电作用所控制.是一个快速过程.而杀灭过程则伴随着细胞壁在纤维表面的溶解.是一个慢过程.菌体耗氧测定法与扫描电镜观察法所获得的结果具有一致性.并可广泛应用于研究抗菌纤维的抗菌作用机理及过程特性.
关键词:表面接触消毒剂;季铵盐;大肠杆菌;耗氧速度
传统的饮用水净化过程通常采用臭氧、次氯酸钠和高锰酸钾等小分子消毒剂.这些消毒剂残留在水中造成水体的二次污染.此外,卤素容易和水中分子量小于3000的腐殖质发生反应,产生三卤甲烷(THM)以及各种致癌和致突变的卤化物,对人体的危害极大.近年来出现的高分子抗菌剂(又称表面接触消毒剂)是将扰菌基团共价结合在不溶性载体上,这不仅可以有效地避免二次污染。而且可以重复利用. 由于抗菌基团集中在载体表面且浓度高,也使消毒时间缩短.因此高分子抗菌剂已成为目前水处理剂研究的热点. 
目前共价型高分子抗菌剂的研究主要集中于季铵盐、季鏻盐及吡啶盐等.这些高分子抗菌剂可有效地降低溶液中的活菌数.文献的研究结果表明.吡啶盐类抗菌剂对菌体具有强烈的吸附作用,但被吸附的菌体依然保持活性.因此吡啶盐类抗菌剂可作为微生物载体.Kanazawa等针对季鏻盐类高分子抗菌剂。考察了鏻盐的种类、鏻盐基团在主链或者侧链的位置以及鏻盐单体的侧链烷基种类等因素埘其抗菌能力的影响.并将此类材料的抗菌能力归因于表面活性剂形成胶团从而干扰细菌细胞膜组成。
对于扰菌机理的研究,目前认为小分子季铵盐的抗菌作用过程可以分为6步:(1)吸附到菌体表面;(2)穿透细胞壁;(3)与细胞膜结合;(4)扰乱细胞膜组成;(5)胞内物质如K ,DNA.RNA 等的泄漏;(6)菌体死亡.
高分子化后的季铵(鏻)盐型接触消毒剂的灭菌机理目前尚不十分清楚.但一般认为.其作用过程也服从以上步骤.季铵盐分子带正电,经高分子化后,相对分子量增大,电荷密度提高.由于微生物细胞表面带负电,而且细胞膜内含有的鏻脂以及一些膜蛋白水解也带负电.因此.消毒剂相对分子量的增大有助于(1),(3),(4)步的进行.同时,由于相对分子量增大,分子变大,在扩散穿透细胞壁时的阻力也增大,因此,(2)步受到阻抑.但就综合效果而言,高分子化的消毒剂比相同结构的小分子单体的抗菌性和稳定性均有大幅度提高.
目前高分子抗菌剂的扰菌饥理,即其抗菌作用基于杀菌还是抑菌,尚未有定论或直接的证据.这主要是由于固相表面的菌体形态及其生物学活性测定较为困难.特别是当菌体的总体浓度很低时。定量测定就更为困难.
本文以一种新型的表面接枝季铵盐型高分子材料对大肠杆菌的抗菌过程为例,测定了大肠杆菌在抗菌材料表面的吸附特性.采用微生物耗氧速度测定法和扫描电镜观察法研究抗菌剂对大肠杆菌的抗菌作用过程.结果表明,此季铵盐类抗菌剂具有很好的杀菌作用,其抗菌过程由吸附和杀菌两个步骤构成,不同阶段的耗氧速度及微生物形态具有显著的差异.
1 实验部分
1.1 试 剂
1.1.1 表面接枝季铵盐型高分子抗菌材料在纤维素的纤维的表面接枝季铵盐单体甲基丙烯酰氧乙基一苄基一二甲基氯化铵(methacryloxykthyl benzyl dimethylammonium chloride,DMAE—BC).有关详细合成方法和表征结果将另文报道.
1.1.2 菌种E.coli JM105,由清华大学化工系生物化学研究所提供.
1.2 抗菌纤维对大肠杆菌的吸附过程
取100 mL菌龄为18 h的E.coli加入到300 mL三角瓶中,其浓度约为10 CFU/mL,投入一定量灭菌后的高分子抗菌纤维,于37℃ ,以150 r/min的速度振荡.定时取样,通过级度稀释法,以平板计数测活菌浓度,浓度计数为菌落形成数/mL(CFU/mL).实验中以未进行抗菌接枝处理的高分子纤维作为空白样对比.
分别向100 mL浓度为10 CFU/mL的大肠杆菌溶液中加入0.5 g未接枝季铵盐的空白纤维和接枝率为50% 的抗菌纤维,然后测定上清液中的菌浓度随时间的变化.
在100 mL浓度为10 CFU/mL的大肠杆菌菌液平行样品中分别加入不同量的接枝率为25% 的抗菌纤维,在水平摇床上以150 r/min速度混和,采用平板计数法测量上清液中的菌浓度,考察抗菌纤维用量对吸附性能的影响.
1.3 抗菌纤维对大肠杆菌耗氧特性的影响
大肠杆菌是兼性厌氧菌,在氧气充足的情况下,将进行有氧呼吸.在基质充分的情况下,菌液中的氧消耗速度反映了大肠杆菌的整体活性,因此测定其耗氧速度是表征其是否被杀灭的重要证据.我们采用溶氧电极测定大肠杆菌溶液中溶氧(Do)的变化,并由溶氧曲线求得该含菌溶液的氧消耗速率,以耗氧速度(0UR)来表征菌体整体活性.
在10 mL菌龄为18 h,浓度为10 CFU/mL的大肠杆菌液中加入0.1 g抗菌纤维,然后将锥形瓶密闭,测量其内溶液在不同时间下的耗氧速度.定义原始菌液的耗氧速度为1,对应的菌活力亦为1,由此可从测得的相对耗氧速度计算得出溶液中菌的相对活性,得到加入抗菌纤维后溶液中菌的相对活
力变化曲线.
1.4 抗菌纤维表面的直接观察
将0.5 g接枝率为50%的抗菌纤维和100 mL菌浓度为10 CFU/mL的菌液混合接触,在不同时间时取样,用扫描电镜直接观察纤维表面微生物的形态及其数量的变化.制样操作采用二氧化碳临界干燥法,最大程度地减少制样过程对微生物形态的影响.
2 结果与讨论
2.1 抗菌纤维吸附性能
未经接枝处理的空白纤维并不能使溶液中活菌量降低,而加入接枝季铵盐的抗菌纤维后,5 min内悬浮液中的活菌数下降至少6个数量级,随着接触时间的延长,上清液菌浓度的降低速度减慢.悬浮液中活菌数的迅速降低表明抗菌纤维对菌体有非常强烈的吸附作用.这是因为季铵盐具有N+官能团,接枝到纤维上后,使纤维表面带正电,而大肠杆菌细胞表面带负电,静电作用使得大肠杆菌快速吸附在抗菌纤维表面,从而导致上清液中菌数的迅速降低.而后期上清液菌浓度降低速度减慢,则预示着抗菌纤维由于已经吸附了大量的大肠杆菌而导致吸附位点减少,同时部分净电荷被大肠杆菌中和,吸附推动力下降.
2.2 抗菌纤维用量对吸附性能的影响
由图2可知,随着抗菌纤维用量的增加,上清液中的菌浓度下降的速度显著加快,终端菌浓度水平显著降低. 这主要是由于在接枝率一定的情况下,抗菌纤维用量的增加提高了季铵盐基团的浓度,由此导致吸附速度提高和吸附容量增大,此外抗菌纤维用量的增多也强化了纤维与菌液的接触,使吸附过程大大加快.结果进一步证实了静电作用是导致大肠杆菌吸附在抗菌纤维上的主导机制.但纤维使用量的过分增大会导致纤维在溶液中团聚,不利于纤维和菌液的充分接触.
2.3 抗菌纤维对菌体耗氧活性的影响
由于大肠杆菌是兼性厌氧型细菌,其在水中的代谢速度可以通过测定水中氧气的消耗速度来表征.因此对于菌和纤维的混合液的溶氧消耗速度研究,可以反映纤维表面菌体的活性.
加入抗菌纤维后,溶液中的菌相对活性在0.5 h内下降近5O%,而在5 h之后,相对活性接近0.表明所采用的抗菌纤维的可能作用机制是,首先通过静电作用将大肠杆菌吸附在抗菌纤维表面上,然后再将其杀灭,与杀灭过程相比,吸附过程为一快速反应过程.
2.4 抗菌纤维表面的直接电镜观察
未接触大肠杆菌溶液的抗菌纤维呈现出比较光滑的表面,而和菌液混合5min后,绝大多数纤维表面都呈现明显的菌斑,放大后,可以观察到材料表面吸附了大量的大肠杆菌.而且菌体具有清晰的外廓及明显的立体结构,菌体在材料表面单层排列.而随着接触时间的增长,3 h后,在整个样品中难以找到具有明显菌斑的纤维,而将少数的具有菌斑的纤维在放大后,其表面被覆盖程度远比接触5 min的纤维小,可以观察到具有正常形态的菌体数量很少,而纤维表面则被一层颗粒物质覆盖,经放大观察后为微生物的残体.
表面接枝DMAE—BC抗菌纤维的抗菌作用过程分为静电吸附和灭活两步.静电吸附是一个快速过程,纤维在溶液里可以充分溶胀,依靠静电作用使菌体被吸附到纤维表面.这个过程通常在30 min内达到吸附饱和. 由于大肠杆菌的呼吸链存在于细胞膜上,在因静电作用而被吸附到纤维上后,在初始阶段至多50%的表面被纤维作用,使呼吸链上的酶受到限制,而同时氧及其它小分子营养物质的渗透也都受到影响.因此在30 min时,呼吸活性下降到初始的50%.然而此时的微生物受到的影响主要是物理吸附作用,仅仅代谢受阻.微生物对纤维的覆盖程度很高,形态依然保持完好,有比较清晰的边界与立体结构.
在吸附饱和后,耗氧活性的变化反映了接枝单体对菌体的作用,使微生物失活的过程.季铵盐单体扰乱了胞膜的双层结构,影响膜的渗透性,破坏菌体内外的渗透压平衡,迫使胞内物质泄漏.从而导致细胞变形以致于完全被破坏死亡.样品在转换多个视野时依然很难找到明显的菌斑以及具有明显形态的细胞,说明大部分大肠杆菌已经被裂解致死.
综上所述,在纤维表面改性接枝季铵盐后,纤维对菌体具有很强的吸附能力,而且纤维具有很高的吸附容量.抗菌纤维的加入,使菌液的耗氧速度明显降低,说明纤维表面上的菌体活性被明显抑制.通过扫描电镜的直接观察,同样可以看到纤维表面的菌量随时间增长呈现减少趋势,并且可以观察到大量的、明显的细胞碎片,说明纤维对菌体具有很强的裂菌和杀灭作用.这两种测定方法所得的结果是一致的.


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